Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

[sergey zhukov]

В статьях про ПЦР написано, что перед собственно репликацией ДНК ее спираль нужно расплести. Причем это делается простым нагреванием раствора с ДНК примерно до 100С без участия каких-либо ферментов.

А когда репликация ДНК происходит в живой клетке, то для ее "расплетения" используется фермент топоизомераза, который фактически занимается не расплетением спиралей, а переносом одной ветви сквозь другую методом их разрезания и сшивания.

Правильно я понимаю, что при нагревании ДНК при проведении ПЦР действительно происходит полное расплетение спирали на две отдельные цепи по всей длине без необходимости разрезов и склеиваний, а в живой клетке происходит нечто другое: только локальное, точечное "расплетение" спирали методом ее разрезания и склеивания прямо в месте текущего реплицирования?

[DimaM]

sergey zhukov в сообщении #1593293 писал(а):

А когда репликация ДНК происходит в живой клетке, то для ее "расплетения" используется фермент топоизомераза

Топоизомеразы не участвуют в репликации. Они занимаются изменением сверхспирализации.

[sergey zhukov]

DimaM
Мне вот что интересно было выяснить. В книжке Максима Франк-Каменецкого "Самая главная молекула" говорится:

Цитата:

Открытие топоизомераз и выяснение механизма их работы лишило почвы одно из основных возражений против двойной спирали, всплывающее вновь и вновь за прошедшие с момента открытия двойной спирали десятилетия. Очень многих в течение этих лет смущало то, что ДНК должна раскручиваться при репликации. Неужели она крутится в клетке, словно тросик в спидометре?

Разные люди отнеслись к этому по разному. Одним это не казалось странным. Другие отмахивались - мол, как-нибудь все уладится. Третьи придуывали хитроумные объяснения. Один физик-теоретик, например, утверждал, что одна цепь может пройти сквозь другую путем квантового туннелирования. И наконец, были такие, кто усматривал в этом явный дефект модели Уотсона-Крика. Они настаивали на том, что по крайней мере в клетке ДНК - не двойная спираль.

По-видимому, правы были те, кто занял выжидательную позицию. Похоже, что топоизомеразы решают все подобные проблемы. Во всяком случае они способны создать в клетке такие условия, при которых цепи и впрямь как бы туннелируют друг сквозь друга. Как все это происходит реально в клетке - еще предстоит выяснить. Пока ясно одно - основной аргумент критиков двойной спирали, которым они пользовались многие годы, потерял силу.

Т.е. в клетке молекула ДНК не столько раскручивается, сколько разрезается и сшивается. В этой книжке так же говорится о том, что молекула ДНК, вообще говоря, может случайно завязаться в узел, и как топоизомеразы "срезают" эти узлы.

Вообще, мне кажется невероятным, что огромные молекулы ДНК вообще так редко запутываются, завязываются в узлы или соединяются в спираль с собственными участками. Скажем, при плавлении ДНК (при простом нагреве) спираль полностью расплетается именно без разрывов цепей. А при последующем охлаждении эти цепи способны снова сплестись обратно. Вероятно, тут уровень ошибок просто зашкаливает, и удачно сплетается назад (да и расплетается тоже) лишь малая часть молекул. Или же молекула ДНК сконструирована так, чтобы обойти эти проблемы. Или же тут речь только об очень коротких кусочках молекул ДНК. Короче, трудно понять, как это может работать без ферментов, которые способны "срезать" узлы и устранять запутывание.

[ipgmvq]

sergey zhukov в сообщении #1593629 писал(а):

ДНК вообще так редко запутываются, завязываются в узлы или соединяются в спираль с собственными участками

Если это находится в центре интереса, то возможно стоит уйти от дискурса о ДНК и пойти выше по структуре, рассмотрев понятия хромосомы, хроматина, нуклеосомы, гистоновых белков. Сама ДНК — это только часть этих структур.

[sergey zhukov]

В книжке Сэма Кина "Синдром Паганини" интересно сказано по этому поводу:

Цитата:

Однако представления Уотсона и Крика по поводу общей формы ДНК, равно как и их представления о форме А, Ц, Г и Т, располагались на очень зыбкой почве. Принимая во внимание то, как быстро делятся клетки, в 1950-х годах биологи высчитали, что двойная спираль должна была бы раскручиваться со скоростью 150 оборотов в секунду – бешеная скорость. Еще больше настораживает, что математики, основываясь на теории узлов, доказывают, что разделение нитей спиральной ДНК – первый этап их копирования – топологически невозможно. Две неорганизованные спиральные нити не могут быть разделены поперек – они для этого слишком сильно запутаны, слишком переплетены. Поэтому в 1976 году некоторые специалисты начали продвигать альтернативную структуру ДНК – «застежку-молнию». В такой структуре вместо одной длинной двойной правосторонней спирали присутствует правосторонняя и левосторонняя половины, которые чередуются по всей длине цепочки ДНК: это позволяет спирали успешно разделяться. В ответ на критику теории двойной спирали следует отметить, что Уотсон и Крик часто обсуждали альтернативные формы ДНК, но практически всегда они (особенно Крик) сразу отвергали прочие версии. Крик часто давал технически убедительные обоснования своих сомнений, но однажды он ожидаемо добавил: «Кроме того, другие модели были уродливы». В конце концов математики оказались правы: клетки не могут просто взять и раскрутить двойные спирали. Вместо этого используются специальные белки, которые надрезают ДНК, встряхивают и разделяют его цепочки, а затем вновь соединяют их. Элегантная двойная спираль все-таки может участвовать в таком внешне нескладном процессе, как редупликация.

[GraNiNi]

sergey zhukov
Отказавшись от двойной спирали нужно было бы как-то по-другому объяснить и ее рентгенограмму.

"Еще до совместной работы Крика и Уотсона английский химик и специалист по рентгенокристаллографии Розалинд Франклин получила знаменитую фотографию 51 (рентгенограмма структуры ДНК), которая выявила двойную спираль в основе молекулы. Это экспериментальное подтверждение определило становление генетики как науки. Франклин была ассистенткой физика и молекулярного биолога Мориса Уилкинса, который впоследствии стал работать над изучением ДНК вместе с Криком и Уотсоном. В 1962 году все трое мужчин получили Нобелевскую премию «за открытия, касающиеся молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их значения для передачи информации в живой материи». Что касается Розалинд Франклин, то, к сожалению, ее роль в исследованиях ДНК была широко признана лишь позднее."